ההיבט המוסרי. כדי לבחון את התנהגותן של חיות לא נדרשות, באופן עקרוני, אלא תצפיות בלבד. ואכן, חלק מן המחקר נערך באמצעות תצפיות ללא פגיעה מיוחדת בחיות - אך לרוב החיות הנצפות מצויות בתנאי ניצול קשים. בנוסף לכך, כדי לבדוק באופן מבוקר כיצד מתנהגת חיה מפוחדת, מתוסכלת, או כואבת, יוצרים חוקרים מסוימים במתכוון פחד, תסכול וכאב בתנאי המעבדה.

נורמליות. ההסתמכות על התנהגויות חריגות להערכת סבל מבוססת על ההנחה, שקיים טווח של דגמי התנהגות נורמליים, אשר חריגה ממנו מרמזת על סבל. שלא כמו ההשוואה הכללית בין תנאים טבעיים לתנאי שבי, תצפיות בהתנהגות חושפות עדויות ישירות לסבל. כדי לברר מהי התנהגות חריגה, יש צורך לצבור תחילה ידע רב על התנהגויות נורמליות. מכלול דגמי ההתנהגות (אתוגרם) הטבעיים מושווה להתנהגות במצבים לא טבעיים, והבדלים גדולים בין ההתנהגויות במצבים אלה מרמזים על סבל, אם כי לא בהכרח מעידים חד-משמעית על קיומו.

הקבלה עם תגובות פיסיולוגיות. כפי שראינו בדיון על מדידות גופניות המעידות על סבל, גירויים מסוכנים מעוררים שינויים הורמונליים ועצביים. מדענים מסוימים מחפשים התאמה בין תגובות פיסיולוגיות אלה לבין תגובות התנהגותיות: עם הופעת גירוי חיצוני, מופנית תשומת-הלב אל מקור הגירוי, ואם הוא נראה מסוכן, החיה מגיבה בבריחה, איום, התקפה או קפיאה במקום. במקביל לכך מופיעות תגובות מגוונות בהתאם למין החיה, כגון: קריאות, הזעה, סמירת שיער או הטלת שתן. קיימים הבדלים אישיים בין התגובות של חיות שונות מאותו מין: למשל, כשפועלים מעמיסים חזירים על רכב, חזירים רבים בורחים בצרחות, אחרים קופאים במקום ואחדים מנסים לנשוך את האדם המזרז אותם. תגובות אלה, כמו השינויים הפיסיולוגיים הנלווים אליהן, נחשבות כהסתגלות משום שהן צפויות להועיל לחיה ומעידות בדרך-כלל שמצבה הכללי טוב. ייתכן - אך אין זה הכרחי - שנלווה אליהן סבל. אם הסכנה לא חלפה, התנהגות החיה מקבילה לתגובות הפיסיולוגיות של התנגדות ולבסוף התמוטטות מערכות ההסתגלות (תשישות). מצב זה נוטה להצביע על סבל, במקביל לתגובות פיסיולוגיות, כגון גדילת בלוטת האדרנלין; אולם התגובות ההתנהגותיות של מינים שונים ייחודיות יותר מהתגובות הפיסיולוגיות. כל שגרת יומה של החיה עלולה להשתנות. לדוגמה: חוקר שכלא חולדות יחד מצא, שהחולדה החלשה יותר צמצמה את כל פעילויותיה, כולל האכילה, לזמן שבו ישנה החולדה החזקה יותר.

תסכול. אחת הגישות במחקר מבוססת על ההנחה, שתנאים מסוימים כרוכים בהכרח בחוויה שלילית, ויש לחשוף את דגמי ההתנהגות הטיפוסיים לחוויה זו - בעיקר במחקר במעבדה - ולאחר מכן לאתרם בתנאי ניצול מסחריים. הניסויים, כצפוי, פוגעים בחיות, והם דומים לניסויים שאינם מיועדים לקידום רווחתן (למשל: ניסויים בגרימת תסכול בחתולים על-ידי כיסוי קערות המזון שלהם בזכוכית). גם תצפיות בחיות בשבי, ללא ניסוי, מגלות התנהגויות תסכול נטולות אפקט ("פעילות ואקום") החושפות צורך נפשי לבצע פעולה מסוימת. למשל, בתעשיות החקלאיות:

תרנגולות הכלואות בכלובי סוללה ללא גישה לעפר, מבצעות על הסורגים את כל התנועות של אמבט עפר. הן גם מבצעות באוויר תנועות של נטילת אניצי קש - ביטוי לדחף לבנות קן. עגלים שנשללה מהם האפשרות לינוק, מוצצים במשך זמן רב את ידית הדלי, שממנו סיימו זה מכבר לשתות בכמות הנחוצה להם.

קונפליקט. דומה לכך היא תגובת החיה על האפשרות לבחור בין פעולות רצויות (למשל: להילחם או לברוח?). חיות בקונפליקט מבצעות לא פעם העברה displacement)): כלומר, במקום להכריע, החיה מתחילה להתנקות, לנקר בקרקע, לרחרח עצמים בסביבה וכדומה. תסכול וקונפליקט קיימים גם בטבע, והתנהגויות הנלוות אליהם נחשבות כהסתגלותיות ולאו דווקא גורמות סבל (לדוגמה: כלב המסתובב על השטיח בסלון לפני רביצתו, כאילו כדי לשטח עשב - פעילות ואקום - ודאי אינו סובל מכך). בטבע, מצבי קונפליקט ותסכול נפתרים מהר, ואילו בשבי, הם מתמשכים עם ההתנהגויות הנלוות אליהם וסביר להניח שהם מהווים מקור לסבל.

התנהגות לא נורמלית. לא כל התנהגות חריגה מרמזת על סבל. התנהגויות חריגות רבות מעניקות פורקן רגעי מסוים, עד כי לעתים נדמה שהחיה נהנית (למשל: תצפיות בגני חיות מרמזות, ששימפנזים נהנים לזרוק את גלליהם במבקרים, ופילים נהנים להשתין על המבקרים). פעילויות אחרות, מספקות או סתגלניות לכאורה, הן אוננות (תחליף להזדווגות), ריצה של מכרסמים על גלגל בכלוב (תחליף לפעילות חופשית), וליקוק עצמי בעגלים שהופרדו מאמותיהם (תחליף ליניקה). אולם המדובר רק בתחליפים לכאורה. התנהגויות לא נורמליות אלה שונות ביותר מן ההתנהגות שהן מבקשות להחליף, וניתן לשער שהחוויה, עבור החיות, שונה מאוד ולא מספקת. עובדה זו אינה מוטלת בספק כאשר ההתנהגות גורמת פגיעה עצמית. קופים בגני חיות, למשל, נושכים את עצמם לעתים בעוצמה כזו, שהם צורחים מכאב; ציפורים בשבי, כגון תוכים, מורטות לעתים את נוצותיהן.

התנהגות סטריאוטיפית. חזרה מתמשכת על פעולות מסוימות שאינן משיגות דבר, לעתים שעות רבות ברציפות, היא סימן לסבל. זוהי "התנהגות סטריאוטיפית". למשל: טורפים הצועדים בכלוב בגן החיות במסלול אינסופי קבוע; וחזירות הלועסות את סורגי תאי ההריון שלהן. להתנהגויות הסטריאוטיפיות מקורות שונים, בהתאם למין החיה. למשל, צעידת תרנגולות במקום בכלוב סוללה קשורה בהיעדר קן להטלה; וניקור חוזר במקום אחד בכלוב על-ידי קנריות קשור בדיכוי מנהגי האכילה שלהן. ההתנהגויות הסטריאוטיפיות עשויות להשתנות לפי ניסיון קודם של החיות. למשל, קופים שנלכדו בטבע קופצים בשבי מעלה ומטה, ואילו קופים שנולדו בשבי נוטים להתנדנד במקום.

תנועות ושליטה בגוף. גירויים מעיקים גורמים שינויים טיפוסיים בתנועות גוף פשוטות. כאב, למשל, ניתן לזיהוי ולהערכה לפי מחוות טיפוסיות, הנמדדות לפי תדירותן ועוצמתן. הימנעות משימוש באיבר הכואב היא הנפוצה ביותר. יונקים מלקקים את האזור הפגוע. קיימות תגובות מקומיות טיפוסיות: שינויים בתנוחת הגוף (כאב בבטן), עצימת עין כואבת, הטיית הראש וטלטולו (כאב באוזן), הימנעות מאכילה (כאב בפה) ותגובה עזה למגע במקום הפגוע. נוכחות מתמשכת של גירויים מעיקים, מעוררת דגמי תנועה טיפוסיים. למשל: "עגלי חלב", שנכלאו במשך חודשים בתא זעיר, מתקשים בהליכה כשמוציאים אותם מהתא; ופרות שנכלאו ברפת שרצפתה חלקלקה, מפתחות פעולות היסוס מתמשכות ותנוחות מיוחדות בכל ניסיון לרדת מעמידה לרביצה. ליקויים התנהגותיים אחרים מעידים על שלילת חברה נורמלית במשך חודשים ושנים. למשל: זכרים של צאן ובקר שגדלו ללא מגע חברתי, אינם מצליחים לבצע היטב בבגרותם תנועות הזדווגות; וקופות שגדלו בבידוד, אינן מטפלות היטב בגוריהן.

סימנים מובהקים. אם כן, עצם חריגותה של ההתנהגות אינו מעיד על סבל. אולם מחקר התנהגותי יכול לזהות סימנים לסבל - לפחות במקרים קיצוניים: אם ההתנהגות מתמשכת, או שהיא כרוכה בפגיעה ברורה בבריאותה של החיה, או שבדיעבד מסתבר שההתנהגות התדרדרה לפגיעה בבריאות. בכל מקרה, זיהוי התנהגות המעידה על סבל מחייב לרוב ידע רב על התנהגותן הטבעית של חיות ממין זה.